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氯化钙(CaCl2法)制备感受态细胞
发布人:岳阳兴湘化工有限责任公司 时间:2017年03月09日

氯化钙(CaCl2)制备感受态细胞

 

什么是感受态细胞?

感受态细胞(competent cell):理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。

 

氯化钙制备感受态细胞的原理

    细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物。钙离子的作用是结合于细胞膜上,是细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙,使外源DNA进入。

 

影响感受态细胞制备的因素有哪些

    1.细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期                      的细胞(一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株 OD6000.5 时细胞密度是 5 × 107/ml )。

    2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行。

    3.经 CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的)。

    4.化合物及无机离子的影响:在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如 Mn2+ Co2+)、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高( 100-1000 倍)。

    5.所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。

    6.质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的 DNA

7.一定范围内,转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比

 

感受态细胞制备中,加了两次氯化钙,它们的作用分别是什么?

除了增加细胞通透性之外,第一次还有洗净之前一步残留的LB液体的作用

 

 

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